摘要：维氏气单胞菌是一种条件致病菌,普遍有着于海水、淡水和污水等环境中,河水及海产品中均能检出维氏气单胞菌,它能够引起人类的化脓性关节炎、腹泻和败血症等疾病,在水产养殖动物方面,可以引起泥鳅、中华绒螯蟹、锦鲤等死亡,造成巨大的经济损失,严重危害我国渔业及水产业的进展。现有斑点叉尾(?)维氏气单胞菌感染的探讨报道集中在病原的分离鉴定上,而关于维氏气单胞菌引起斑点叉尾(?)疾病的流行病学资料匮乏。流行病学作为探讨疾病分布规律及影响因素的一门学科,为探讨疾病病因,制订疾病防控对策提供重要参考资料。本探讨旨在对四川省斑点叉尾(?)维氏气单胞菌病进行的流行病学调查,为临床诊断该病原菌和进行分子流行病学检测提供可靠的策略,为维氏气单胞菌病的预防和制约提供科学的论述依据。采集来自四川不同地区自然发病的斑点叉尾(?),采取TSA培养基,对细菌进行分离培养与纯培养、菌落形态特点及理化特性等表型特点鉴定,同时进行16S rDNA基因序列的测定、浅析相关细菌相应序列的同源性和构建系统发生树；结合表型特点鉴定结果及细菌发育学浅析的结果进行分离菌的种属判定,并在此基础上采取ERIC-PCR和AFLP对维氏气单胞菌(39株)进行基因分型,确定引起四川省斑点叉尾(?)爆发性流行性疾病发生的主要流行菌株的基因型。对四川省眉山、绵阳、攀枝花等7个地区自然发病的斑点叉尾(?)进行细菌的分离鉴定,根据细菌的生物学特性,并结合16S rDNA检测结果建立系统发育树,确定分离得到了25株维氏气单胞菌。通过ERIC-PCR对本次分离25株和实验室保存的14株维氏气单胞菌(13株分离自斑点叉尾(?),1株标准菌ATCC35604)进行基因分型,结果显示以相似系数0.77为分界点,39株维氏气单胞菌分为7个基因型,其中48.7%的菌株体现为基因Ⅰ型,7.4%的菌株体现为基因Ⅱ型,5.1%的菌株体现为基因Ⅲ型,第四类群Ⅳ型和第五类群Ⅴ型都只包含一株菌株,显示出与别的菌株有较大的遗传差别；第六类群Ⅵ型包含了4株菌株；第七类群Ⅶ型包含了剩下的9株菌株,约占总菌株数的23%。基因Ⅰ型为四川省维氏气单胞菌的主要流行型,分布于眉山、德阳、绵阳、简阳和成都5个地区。此外,不同地区维氏气单胞菌菌株的基因型差别显著,主要以一种基因型为主,交叉有少数其他基因型。通过AFLP技术对维氏气单胞菌进行基因分型,结果显示以遗传相似系数0.67为分界点,39株维氏气单胞菌分为9个基因型,其中第四类群Ⅳ型包含了14株菌株,约占总菌数的35.9%,第五类群V型包含7株菌株,占了总菌数的17.9%,第六类群Ⅵ型、第八类群Ⅷ型和第九类群Ⅸ型依次占了总菌数的15.4%、7.7%和12.8%,其余的第一类群Ⅰ型、第二类群Ⅱ型、第三类群Ⅲ型和第七类群Ⅶ型都只含有一个菌株。同一聚类群内的菌株的相似系数都在95%以上,亲缘联系较近。不论是ERIC-PCR优势基因型,还是AFLP优势基因型均达到30%以上,说明维氏气单胞菌以一种基因型为主要流行型。维氏气单胞菌的遗传聚群既有一定的地域性,同时也体现出多样性特点,只有少数地区的基因型单一。关键词：斑点叉尾鮰论文维氏气单胞菌论文ERIC-PCR论文AFLP论文分子流行病学论文
本论文由www.808so.com中文摘要4-6
Abstract6-8
英文缩略词表8-12
1 文献综述12-22
1.1 斑点叉尾(?)养殖近况及病害发生近况12
1.2 维氏气单胞菌的探讨进展12-14
1.2.1 维氏气单胞菌的生物学特性12-13
1.2.2 维氏气单胞菌的分类13
1.2.3 维氏气单胞致病有关的毒力因子13-14
1.3 维氏气单胞菌的流行病学特点14-15
1.4 维氏气单胞菌的主要检测技术15-16
1.4.1 生化鉴定15
1.4.2 分子生物学检测15-16
1.4.3 免疫学策略16
1.5 维氏气单胞菌的分型16-21
1.5.1 血清型分型16-17
1.5.2 基因分型17-21
1.6 探讨的目的和作用21-22
第一节 维氏气单胞菌的分离与鉴定22-37
1 试验材料22-24
1.1 试验动物和菌种22
1.2 主要试剂22
1.3 主要仪器22-23
1.4 主要培养基23-24
2 试验策略24-26
2.1 病鱼样品的采集24
2.2 病鱼检验24
2.3 细菌的分离纯化及保存24
2.4 细菌表型特点鉴定24-25
2.4.1 细菌形态与菌落特点检查24-25
2.4.2 培养特性观察25
2.4.3 生理生化特性观察25
2.4.4 鉴定标准25
2.5 16S rDNA基因序列测定与建立系统发育树25-26
2.5.1 模板DNA的制备25
2.5.2 16S rDNA基因序列扩增和测序25-26
2.5.3 16S rDNA基因序列系统发育树的构建26
2.6 细菌回归感染实验26
3 试验结果与浅析26-35
3.1 发病情况26-27
3.2 细菌的分离与纯培养27-29
3.3 细菌鉴定与分类位置的确定29-32
3.3.1 形态及培养特点29
3.3.2 在常用不同培养基上的生长情况及菌落特点29-30
3.3.3 生化特点30-32
3.4 16S rDNA基因序列和系统发育树的建立32-33
3.5 细菌回归感染实验33-35
4 讨论35-37
第二节 维氏气单胞菌的ERIC-PCR基因分型37-43
1 试验材料37-38
1.1 试验菌株37
1.2 主要仪器37-38
1.3 主要试剂38
2 试验策略38-39
2.1 菌株基因组DNA的提取38
2.2 ERIC-PCR扩增38-39
2.3 PCR产物浅析39
2.4 DNA同源性判定39
3 试验结果与浅析39-41
3.1 ERIC-PCR指纹图谱39-40
3.2 维氏气单胞菌ERIC-PCR扩增产物的聚类浅析40-41
3.3 维氏气单胞菌ERIC-PCR基因型在不同地区的分布41
4 讨论41-43
第三节 维氏气单胞菌的AFLP基因分型43-53
1 试验材料43-44
1.1 试验菌株43
1.2 主要仪器43
1.3 主要试剂及配置43-44
2 试验策略44-47
2.1 菌株基因组DNA的提取44
2.2 基因组DNA的酶切44-45
2.3 连接反应45
2.4 PCR预扩增45-46
2.5 选择性扩增46
2.6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳46
2.7 银染46-47
2.8 数据处理浅析47
2.8.1 遗传距离和聚类浅析47
2.8.2 多态带比率的计算47
3 试验结果与浅析47-50
3.1 AFLP选择性引物的筛选47-48
3.2 AFLP指纹图谱及聚类浅析48-49
3.3 维氏气单胞菌AFLP基因型在不同地区的分布49-50
4 讨论50-53
4.1 AFLP基因分型50-51
4.2 ERIC-PCR基因分型和AFLP基因分型的比较51-53
结论与革新53-54
1 结论53
2 革新53-54
参考文献54-60
致谢60
探讨流行病学四川地区斑点叉尾鮰源维氏气单胞菌分子流行病学调查
更新时间：2024-04-02
作者：用户投稿
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