摘要：大肠杆菌DNA复制是以半不连续方式,滞后链的复制引发是由引发体(Primosome)参与完成的。大肠杆菌里,至少有两种引发体已经确认,分别是DnaA-dependent primosome和PriA-dependent primosome o PriA、PriB、PriC、DnaB、DnaC、DnaT和DnaG共同参与了PriA-dependent primosome的组装。,关于PriC的表达及其功能了解的很少,为了研究其在引发体的生物学功能及其作用机制,本课题在大肠杆菌中诱导表达了PriC,经Ni柱亲和层析纯化的蛋白稳定性较差,易沉淀。二级结构和蛋白稳定性预测及限制性蛋白酶水解结果,构建了PriC的截短突变蛋白PriC经Ni亲和层析和superdex75纯化,了稳定性较好的蛋白,经Western blot鉴定为目的蛋白。PriC1-101的圆二色谱分析发现其具有较多的a-hepx和无规卷曲,这为更好的了解其结构奠定了的基础。为了研究PriC与PriB存在作用,将pET21 a-PriC-notag与pET28at-plus-PriB分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达及共纯化发现PriC与PriB存在作用,并且PriC的稳定性提高。全长PriC及PriC1-101分别与PriB的Pull down结果发现,PriC蛋白的C-端氨基酸序列是PriC蛋白与PriB蛋白作用的主要区域,并对PriC蛋白的稳定性有影响。关键词：PriC论文PriC_(1-101)论文PriB论文作用论文
摘要4-6
ABSTRACT6-14
章 绪论14-22
1.1 Primosomes的简介14-17
1.1.1 DnaA-dependent primosome14-15
1.1.2 PriA-dependent primosome15-17
1.2 蛋白纯化方法17-18
1.2.1 凝胶过滤17
1.2.2 离子交换层析17
1.2.3 基因工程构建的纯化标记17-18
1.2.4 亲和层析18
1.3 研究目的和研究方法18-22
章 PriC蛋白的克隆、表达和纯化22-38
2.1 前言22
2.2 实验22-26
2.2.1 主要仪器22
2.2.2 实验试剂22-24
2.2.3 菌株、质粒24-26
2.3 方法26-33
2.3.1 引物的设计与合成26
2.3.2 目的片段的PCR扩增26-27
2.3.3 重组质粒pET21a-PriC的构建27
2.3.4 目的基因的转化27-28
2.3.5 阳性克隆的筛选与鉴定28-30
2.3.6 质粒的测序分析30
2.3.7 重组质粒的诱导表达30-31
2.3.8 PriC蛋白的表达纯化31-33
2.4 结果33-36
2.4.1 PCR产物33
2.4.2 重组质粒的双酶切鉴定33-34
2.4.3 测序结果34-35
2.4.4 PriC蛋白的表达纯化35-36
2.5 小结36-38
章 PriC_(1-101)蛋白的克隆、表达与纯化38-52
3.1 前言38
3.2 实验38-40
3.2.1 主要仪器38-39
3.2.2 实验试剂39
3.2.3 菌株、质粒和免疫分析试剂39-40
3.3 方法40-46
3.3.1 引物的设计与合成40
3.3.2 目的片段的PCR扩增40-41
3.3.3 重组质粒pET21a-PriC_(1-101)的构建41-42
3.3.4 目的基因的转化42
3.3.5 阳性克隆的筛选与鉴定42-43
3.3.6 质粒的测序分析43
3.3.7 PriC_(1-101)蛋白的表达纯化43-45
3.3.8 PriC_(1-101)蛋白Western blot分析45-46
3.3.9 PriC_(1-101)蛋白圆二色谱分析46
3.4 结果46-50
3.4.1 PCR产物46-47
3.4.2 重组质粒的双酶切鉴定47
3.4.3 测序结果47-48
3.4.4 PriC_(1-101)蛋白的诱导表达及纯化48-49
3.4.5 PriC_(1-101)蛋白的Western blot分析49-50
3.4.6 PriC_(1-101)蛋白的圆二色谱分析50
3.5 小结50-52
章 PriC及其突变体PriC_(1-101)与PriB之间作用的初步分析52-70
4.1 前言52
4.2 实验52-54
4.2.1 主要仪器52
4.2.2 实验试剂52-53
4.2.3 菌株与质粒53-54
4.3 方法54-59
4.3.1 pET21a-PriC-notag的构建54
4.3.2 pET28at-plus-PriB的构建54
4.3.3 pET21a-PriB-notag的构建54-57
4.3.4 PriB与PriC-notag作用分析57-59
4.3.5 PriC_(1-101)与PriB的作用分析59
4.4 结果59-68
4.4.1 PCR产物60-61
4.4.2 重组质粒的双酶切鉴定61-63
4.4.3 重组质粒的测序分析63-66
4.4.4 PriB与PriC-notag的作用66-67
4.4.5 PriC_(1-101)与PriB-notag的作用67-68
4.5 小结68-70
第五章 分析讨论70-72
参考文献72-76
附录 缩略语表76-78
致谢78-80
研究成果及发表的学术论文80-82
作者及导师简介82-83
附件83-84
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大肠杆菌DNA复制相关蛋白PriC初步探讨
更新时间：2024-03-13
作者：用户投稿
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