探讨傣药咪多领(云南琵琶甲)抑制兔耳瘢痕增生实验

更新时间:2024-03-23 作者:用户投稿原创标记本站原创
[摘要]目的:观察傣药咪多领(云南琵琶甲)提取物制剂对兔耳增生性瘢痕组织的影响。策略:建立兔耳增生性瘢痕动物模型,术后28天将模型随机分为实验组、阳性药物(康瑞保)对照组和空白对照组,分别外用琵琶甲制剂、康瑞保或生理盐水,4周后观察各组瘢痕形态、瘢痕增生指数(HI)、成纤维细胞数量、胶原密度及转化生长因子TGF-β1的表达。结果:实验组、康瑞保对照组瘢痕增生指数(HI)均较空白对照组低,差异有显著性作用(P<0.05)。实验组、康瑞保对照组成纤维细胞数量和胶原密度与空白对照组比较均减少或降低,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组、康瑞保对照组转化生长因子TGF-β1表达与空白对照组比较均减少(P<0.05)。结论:傣药咪多领(云南琵琶甲)可抑制兔耳瘢痕增生。
[关键词]琵琶甲;增生性瘢痕;动物模型
[中途分类号]R62 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2014)19-1611-04
皮肤受到创伤、炎症刺激后,组织内有过量的成纤维细胞增殖和胶原沉积,以致失去正常皮肤的形态而形成瘢痕。目前,瘢痕的防治仍然是临床上的难题之一。本研究利用兔耳增生性瘢痕模型观察傣药咪多领(云南琵琶甲)制剂对瘢痕组织的作用,为该药防治瘢痕提供初步理论依据。
1 材料和策略
1.1实验药物:云南琵琶甲提取物制剂由云南省中医医院制剂中心提供,采用甲醇热回流并正己烷萃取的策略制备,浓度为0.3g/ml生药。康瑞保(复方肝素钠尿囊素凝胶),由德国麦氏大药厂提供。
1.2实验动物及器材:成年健康大耳白兔12只,体重2.5~3.0kg,雌雄各半。由昆明医科大学动物实验中心提供并饲养,适应性喂养48h后实验。自动石蜡包埋机(Leitz公司,德国),全自动脱水机(Sakura公司,日本),石蜡切片机(Leitz公司,德国),光学显微镜及照相系统(Olympus公司,日本),电热恒温烤箱(上海医疗设备厂)等。TGF-β1一抗、SABC试剂盒(武汉博士德公司),通用型SP检测试剂盒、DAB试剂盒(北京中杉金桥公司)。
1.3实验策略
1.3.1建立动物模型:先用20mg/kg进行兔背肌注,麻醉成功后碘伏液消毒兔耳皮肤。然后在兔双侧耳腹侧分别做6个直径为lcm、间距2cm的园形创面,完整切除全层皮肤,直至软骨膜表面,并完整切除软骨膜。无菌纱布压迫止血后涂擦红霉素眼膏,创面暴露。
1.3.2动物模型分组、给药及处理:创面上皮化后(术后28天)将12只兔的144个创面随机分为3组,即琵琶甲提取物制剂实验组、阳性药物(康瑞保)对照组和空白对照组,每组共有48个创面。实验组、康瑞保对照组从术后28天开始给药,分别于瘢痕局部外涂云南琵琶甲提取物、康瑞保,每次0.5ml/瘢痕,涂药后用敷料封包,使药物充分发挥作用,空白对照组外涂生理盐水,3次/天。给药4周后在同样麻醉下切取瘢痕组织标本,切片观察。组织学观察:标本用体积分数10%甲醛缓释液固定,脱水,石蜡固定包埋,切片,厚度5μm,切片后苏木精-伊红染色,在显微镜下观察。免疫组织化学观察:瘢痕组织石蜡包埋、切片,厚度4μm,二甲苯及梯度乙醇脱蜡至水,3%双氧水灭活内源性过氧化物酶,柠檬酸缓冲液中高压修复抗原,5%山羊血清封闭20min ,加入1:100倍稀释TGF-β1一抗,4℃过夜,再滴加生物素化二抗37℃孵育20min,SABC工作液37℃处理20min,DAB溶液显色,苏木精复染,1%盐酸乙醇溶液分化,饱和碳酸锂溶液返兰,脱水透明后封片观察。
1.4观察指标:①大体观察:在给药前(术后28天)、给药4周后(术后56天),分别记录兔耳瘢痕大小、颜色、质地及瘢痕厚度;②瘢痕增生指数(HI):HE染色组织切片于低倍镜下用测微尺测量,按公式m=A/B计算瘢痕增生指数。A=瘢痕凸起最高点至耳软骨表面的垂直高度;B=瘢痕周边正常皮肤皮缘至耳软骨表面的垂直高度;③每张组织切片分别随机选5个不重叠视野进行图像观察,定量检测成纤维细胞数量和胶原密度;④转化生长因子TGF-β1检测:给药4周,切取瘢痕组织,免疫组化法观察各组标本表达情况。
1.5统计学处理:数据均以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行数据处理。对指标进行单因素方差分析和t检验,P<0.05有统计学差异。
2 结果
2.1瘢痕形成情况:创面伤口约7天后逐渐愈合,14~20天创面完全上皮化。给药前(术后28天)见高出皮面的增生块,淡红色,触之较软。给药4周后(术后56天)空白对照组增生块较硬,充血明显呈暗红色,范围不超过原创沿,厚度约为兔耳腹面皮肤厚度的3倍左右,多数瘢痕中心出现状突起;实验组、康瑞保对照组瘢痕稍高出皮面,淡红色,触之较软,有皱褶(如图1)。
2.2 瘢痕增生指数情况:给药4周实验组、康瑞保对照组和空白对照组HI分别为(2.10±0.32)、(2.01±0.29)和(3.31±0.45)。经统计学分析,治疗组与康瑞保对照组之间HI差异无显著性作用(P>0.05);治疗组、康瑞保对照组与空白对照组之间HI差异有显著性作用(P<0.05),见表1。
2.3组织切片观察:给药4周时,空白对照组真皮层明显变厚,为周边正常真皮层厚度的3~4倍,主要是大量成纤维细胞增殖,胶原纤维增加、增粗,致密并排列紊乱,其间有少量炎性细胞,结构近似人的增生性瘢痕组织。治疗组、康瑞保对照组真皮层厚度约为正常真皮层厚度的2倍,成纤维细胞数量较少,胶原纤维密度下降明显,表层排列稍规则,成水平向,内层排列紊乱(如图2)。治疗组、康瑞保对照组成纤维细胞数量和胶原密度与空白对照组比较均减少或降低,差异明显(P<0.05),见表2。免疫组织化学检测结果:TGF-β1阳性信号为棕颗粒,主要表达在表皮的基底层细胞和真皮附属器的上皮细胞、血管内皮细胞和真皮深层的成纤维细胞胞浆及细胞表面。实验组、康瑞保对照组TGF-β1呈弱阳性,空白对照组TGF-β1表达较强(如图3)。实验组、康瑞保对照组转化生长因子TGF-β1表达与空白对照组比较均减少(P0.05),见表3。

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