芽孢杆菌新型蛋白酶基因克隆、表达及理化性质探讨-turnitin查重

摘要：本课题组对一株从土壤分离纯化的高产蛋白酶芽孢杆菌BLYS-1了深入研究，该菌所产蛋白酶对大豆蛋白具有较强的水解和脱苦作用，应用潜力。本研究同源序列法克隆了该蛋白酶基因，并在大肠杆菌BL21中了表达；同时对该菌的产酶条件了优化，优化的条件培养该菌后提取纯化蛋白酶，对酶的理化特性了研究；该菌发酵水解大豆蛋白，到大豆肽，并用该大豆肽喂养小鼠，考查了大豆肽对小鼠的主要生理指标的影响，研究结果如下：1.蛋白酶基因克隆及表达GenBank中的蛋白酶基因同源序列设计PCR引物，从芽孢杆菌BLYS-1中克隆了一个新蛋白酶基因NP。该基因与NCBI基因库中登录的枯草芽孢杆菌所产的胞外金属蛋白酶基因（GenBank：L10505.1）同源性达99.39%。以pET28a为出发质粒，构建含有NP蛋白酶基因的表达载体pET28aNP，将该表达质粒导入大肠杆菌BL21中。经50μmol/mlIPTG诱导培养，SDS-PAGE检测，结果NP基因在BL21中表达分子量大小约为30kDa的蛋白，并在干酪素培养基上培养后产生水解圈，该蛋白酶基因的表达产物具有水解蛋白的活性。2.芽孢杆菌发酵产酶条件优化对草芽孢杆菌BLYS-1产酶工艺了初步研究。探讨了以及碳源、糖源和无机盐等培养基的组成以及pH、温度、转速、装液量和接种量等操作条件对蛋白酶表达的影响。培养基组分优化结果1.0%淀粉以及1.5%玉米粉对该菌的发酵酶活影响。芽孢杆菌发酵条件的单因素实验初始pH9、装液量100ml/250ml、温度35℃、接种量8%、转速150r/min等单因子条件于蛋白酶产量的提高。最佳的操作条件组合为T（35℃）pH（9）装液量（100ml）接种量（8%），正交优化可以使发酵酶活达700U/ml。利用响应面法优化发酵产酶工艺，模拟出发酵的最高酶活力为800.650U/ml。3.蛋白酶理化性质分析提取芽孢杆菌BLYS-1蛋白酶，探讨pH值、温度、有机溶剂、金属离子、氧化剂和EDTA等对其影响。研究发现，该芽孢杆菌蛋白酶具有一定酸碱耐受性，在pH5-8时活性较高，其最适pH值约为7，最佳反应温度为40-60℃，70%饱和度的硫酸铵基本可以使其完全沉淀，并表现一定的抗氧化性。有机溶剂吐温和异丙醇、变性剂SDS、金属离子SnP~(2+)P、CaP~(2+)P、NiP+P对蛋白酶抑制作用，MgP~(2+)P、ZnP~(2+)P等对该酶有促进作用。以干酪素为底物，测得该酶动力学参数Km值为2.53g/L，Vmax值为6.67μg/s。4.大豆肽对小鼠生理的影响将48只健康的昆明系小老鼠分为六组,分别利用纯净水、大豆多肽液、大豆蛋白酶解液、豆浆液、大豆蛋白液及BLYS-1的大豆蛋白发酵液对其连续灌胃30天,研究每组小鼠的抗疲劳能力及其脾脏、肾脏、肝脏功能及血液特征。研究芽孢杆菌BLYS-1发酵型大豆肽等于小鼠增重,延长小鼠爬杆和游泳时间,并能提高脾脏指数和肾脏指数,增加肝脏糖原储备能力;与纯净水组相比,各种灌胃试剂在一定上于血液中乳酸脱氢酶含量的升高,而发酵型大豆肽可以使血液中血尿氮含量降低。关键词：芽孢杆菌论文基因克隆论文蛋白酶论文发酵条件优化论文理化性质论文生理功能论文
内容摘要4-6
Abstract6-10
引言10-13
章蛋白酶基因克隆13-24
1.1 13
1.2 方法13-17
1.3 结果与分析17-23
1.3.1 蛋白酶基因引物筛选17-18
1.3.2 蛋白酶基因克隆分析18-21
1.3.3 蛋白酶基因工程菌构建21-23
1.4 小结23-24
章芽孢杆菌发酵产酶条件的优化24-36
2.1 24
2.2 方法24-25
2.3 结果及分析25-35
2.3.1 发酵培养基优化25-29
2.3.2 发酵工艺单因子实验29-31
2.3.3 发酵工艺正交优化31-32
2.3.4 响应面法模拟发酵培养基组成32-35
2.4 小结35-36
章蛋白酶理化性质分析36-43
3.1 36
3.2 方法36-37
3.3 结果和分析37-42
3.3.1 L-酪氨酸标准曲线的绘制37
3.3.2 酶解进程曲线37-38
3.3.3 硫酸铵盐析曲线38
3.3.4 酶解最适pH 及对pH 耐受38-39
3.3.5 抗H_20_2分析39
3.3.6 有机溶剂对蛋白酶的影响39-40
3.3.7 变性剂对蛋白酶的影响40
3.3.8 金属离子对蛋白酶的影响40-41
3.3.9 温度对蛋白酶影响41-42
3.3.10 蛋白酶动力学参数的测定42
3.4 小结42-43
章大豆肽对小鼠生理的影响43-49
4.1 43
4.2 试剂与仪器43
4.3 实验方法43-44
4.4 结果和分析44-48
4.4.1 BLYS-1 大豆蛋白水解产物分析44-45
4.4.2 小鼠学特征45
4.4.3 小鼠体重增长情况45-46
4.4.4 小鼠抗疲劳实验46
4.4.5 小鼠肾脏脾脏肝脏指数实验46-47
4.4.6 肝脏糖原含量测定47
4.4.7 血液中LDH 和BUN 分析47-48
4.5 小结48-49
49-50
参考文献50-54
综述54-62
参考文献59-62
致谢62-63
附录63-64
攻读硕士学位期间发表论文63
攻读硕士学位期间奖励63-64
缩略表64
初始pH9、装液量100ml/250ml、温度35℃、接种量8%、转速150r/min等单因子条件于蛋白酶产量的提高。最佳的操作条件组合为T（35℃）pH（9）装液量（100ml）接种量（8%），正交优化可以使发酵酶活达700U/ml。利用响应面法优化发酵产酶工艺，模拟出发酵的最高酶活力为800.650U/ml。3.蛋白酶理化性质分析提取芽孢杆菌BLYS-1蛋白酶，探讨pH值 WWw.808so.com 808论文查重

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