摘要：目的:恶性肿瘤细胞产生的多种生物活性分子,抑制机体的免疫功能,构成肿瘤免疫逃逸的机制。阻断恶性肿瘤细胞的免疫抑制作用,有助于对恶性肿瘤的控制和治疗。灵芝多糖( Ganoderma lucidum Polysaccharides Gl-PS)是灵芝的主要活性成分之一,具有抗肿瘤及免疫调节作用。但其拮抗恶性肿瘤产生的免疫抑制物对免疫细胞的抑制作用,还有待证据加以确认。本实验福州绿谷生物药业技术研究所从段木栽培的灵芝中分离提取、纯化出的灵芝多糖,选择高转移性的小鼠黑素瘤B16F10细胞,探讨灵芝多糖拮抗肿瘤细胞培养上清对淋巴细胞的抑制作用。方法:1.细胞来源:本实验的B16F10细胞是一种来C57BL/6小鼠的高转移黑素瘤细胞系,淋巴细胞为新鲜制备的BALB/C小鼠及C57BL/6小鼠的脾淋巴细胞。2.制备B16F10细胞培养上清(简称肿瘤上清):2×104/ml B16F10细胞,接种于50ml培养瓶,每瓶10ml,培养至细胞长满80%时换液,继续培养8h,培养上清,0.22μm滤纸滤菌,分装,-20℃冻存备用。3.灵芝多糖拮抗肿瘤上清对PHA诱导淋巴细胞增殖的抑制作用实验:取96孔板将C57BL/6小鼠脾淋巴细胞培养于肿瘤上清或正常培养基中,1×106细胞/孔,同时向培养于肿瘤上清中的脾淋巴细胞加入不同浓度的灵芝多糖,以不加灵芝多糖者为对照,培养72小时,用MTT法检测细胞的OD值以判定细胞的增殖活性。4.灵芝多糖拮抗肿瘤上清对混合淋巴细胞反应的抑制作用实验:双向混合淋巴细胞反应。取96孔平底细胞培养板,将等量的1×106细胞/孔的BALB/c小鼠及C57BL/6小鼠淋巴细胞培养于肿瘤上清或正常培养基中,同时向培养于肿瘤上清中的脾淋巴细胞加入不同浓度的灵芝多糖,以不加灵芝多糖者为对照,培养72小时,用MTT法检测细胞的OD值以判定混合淋巴细胞反应。5.免疫细胞化学染色检测灵芝多糖拮抗肿瘤上清对淋巴细胞颗粒酶B和穿孔素表达的抑制作用实验:C57BL/6小鼠脾淋巴细胞培养于肿瘤上清或正常培养基中,1×106细胞/孔,同时向培养于肿瘤上清中的脾淋巴细胞加入不同浓度的灵芝多糖,以不加灵芝多糖者为对照,培养72小时,未贴壁淋巴细胞,涂片,细胞免疫化学染色,显微镜观察结果,以胞浆染成棕色为阳性。6.Western blot检测灵芝多糖拮抗肿瘤上清对淋巴细胞颗粒酶B和穿孔素表达的抑制作用实验:小鼠脾淋巴细胞培养于肿瘤上清或正常培养基中,1×106细胞/孔,同时向培养于肿瘤上清中的脾淋巴细胞加入不同浓度的灵芝多糖,以不加灵芝多糖者为对照,培养72小时,未贴壁淋巴细胞,提取蛋白,应用Western blot方法测定颗粒酶B及穿孔素的表达。7.数据统计分析:应用SPSS15.0统计学软件,对结果单因素方差分析,p0.05表示差别有统计学。结果:1.肿瘤上清对PHA诱导淋巴细胞增殖的抑制作用:MTT结果,在肿瘤上清作用下,PHA诱导后72h的同基因小鼠脾淋巴细胞OD值为1.132±0.086,远远低于RPMI 1640培养液对照组的1.797±0.075,差异具有性(t=16.447,p=000)。2.肿瘤上清对混合淋巴细胞反应的抑制作用:MTT结果,在肿瘤上清作用下,混合淋巴细胞反应的的小鼠脾淋巴细胞OD值为0.825±0.157,远远低于RPMI 1640培养液对照组的1.334±0.083,差异具有性(t=8.097,p=000)。3.免疫细胞化学染色检测肿瘤上清对淋巴细胞颗粒酶B和穿孔素表达的抑制作用:在肿瘤上清作用下,PHA诱导后72h的同基因小鼠脾淋巴细胞穿孔素和颗粒酶B免疫细胞化学染色阳性远低于RPMI 1640培养液对照组。4.Western blot检测肿瘤上清对淋巴细胞颗粒酶B和穿孔素表达的抑制作用:在肿瘤上清作用下,PHA诱导后72h的同基因小鼠脾淋巴细胞穿孔素和颗粒酶B的相对表达分别为0.7662±0.017和0.7857±0.056低于RPMI 1640培养液对照组的1.000,差异有性(t=23.698, p=0.002;t=6.658, p=0.003)。5.灵芝多糖拮抗肿瘤上清对PHA诱导淋巴细胞增殖的抑制作用:MTT结果,在不同浓度灵芝多糖作用下,肿瘤上清作用的PHA诱导后72h的同基因小鼠脾淋巴细胞OD值分别为1.350±0.068、1.400±0.053、1.455±0.046和1.592±0.049,高于未用灵芝多糖作用的对照组的1.132±0.086,且呈现出一定的剂量依赖关系。但还均达到未受肿瘤上清抑制的RPMI 1640培养基对照的1.796±0.075,经方差分析,差异有性(F=97.499, p=000);两两比较除0.2μg/ml与0.8μg/ml、0.8μg/ml与3.2μg/ml组之间比较差异无性外,各组之间差异均有性(p=000)。6.灵芝多糖拮抗肿瘤上清对混合淋巴细胞反应的抑制作用: MTT结果,在肿瘤上清作用下,同基因小鼠脾淋巴细胞与异基因小鼠脾淋巴细胞混合培养后72h的小鼠脾淋巴细胞OD值分别为1.170±0.205、1.209±0.125、1.234±0.148和1.247±0.148,高于未用灵芝多糖作用的对照组的0.825±0.157,差异有性(F=11.335, p=000)。虽呈现出剂量依赖趋势,但两两比较分析各剂量组之间除均与未用灵芝多糖作用的对照组差异有性(p=000)外,差异均无性(p0.05);各剂量组的结果均接近未受肿瘤上清抑制的常规RPMI 1640培养基对照的1.335±0.083,经方差分析,差异性(p0.05)。7.免疫细胞化学染色检测灵芝多糖拮抗肿瘤上清对淋巴细胞颗粒酶B和穿孔素表达的抑制作用:在不同浓度灵芝多糖作用下,肿瘤上清对PHA诱导后72h的同基因小鼠脾淋巴细胞穿孔素和颗粒酶B表达的抑制作用减低或消失,免疫细胞化学染色阳性高于未经灵芝多糖作用的对照组。8.Western blot检测灵芝多糖拮抗肿瘤上清对淋巴细胞颗粒酶B和穿孔素表达的抑制作用:在不同浓度灵芝多糖作用下,肿瘤上清对PHA诱导后72h的同基因小鼠脾淋巴细胞穿孔素和颗粒酶B表达的抑制作用减低或消失,穿孔素蛋白表达分别为1.073±0.040、1.127±0.037、1.240±0.0143和1.352±0.035,高于未用灵芝多糖作用的对照组的1.000,且呈现剂量依赖趋势,差异有性(F=66.256, p=000)。其中高剂量组(3.2μg/ml和12.8μg/ml)已经接近未受肿瘤上清抑制的对照组的1.306±0.029,差异性(p0.05)。两两比较分析各剂量组与未用灵芝多糖作用的对照组之间差异均有性(p0.05)或性(p0.01),除0.2μg/ml与0.8μg/ml之间差异性p0.05)外,其它各剂量组之间差异均有性(p0.01)。颗粒酶B蛋白表达分别为1.021±0.041、1.089±0.026、1.210±0.079和1.259±0.089,高于未用灵芝多糖作用的对照组的1.000,且呈现剂量依赖趋势,差异有性(F=10.954,p=000)。其中高剂量组(3.2μg/ml和12.8μg/ml)已经接近未受肿瘤上清抑制的对照组的1.277±0.090,差异性(p0.05)。两两比较分析低剂量组(0.2μg/ml、0.8μg/ml)与未用灵芝多糖作用的对照组之间差异性(p0.05)高剂量组(3.2μg/ml、12.8μg/ml)有性(p0.01),各剂量组之间除0.2μg/ml与0.8μg/ml之间、0.8μg/ml与3.2μg/ml之间、0.8μg/ml与12.8μg/ml之间、3.2μg/ml与12.8μg/ml之间差异性(p0.05)外,其它各剂量组之间差异均有性(p0.05)或性(p0.01)。:1. B16F10黑素瘤细胞培养上清对小鼠脾淋巴细胞有免疫抑制作用。2.灵芝多糖可拮抗B16F10黑素瘤细胞培养上清对小鼠脾淋巴细胞的免疫抑制作用。关键词：灵芝多糖论文黑素瘤论文淋巴细胞论文PHA论文颗粒酶论文穿孔素论文
摘要5-9
Abstract9-14
英文缩写14-15
研究论文 灵芝多糖拮抗黑素瘤细胞可溶性分子对淋巴细胞免疫功能的抑制作用的研究15-55
前言15-17
与方法17-27
结果27-30
附图30-41
附表41-44
讨论44-50
50-51
参考文献51-55
综述55-67
参考文献62-67
致谢67-68
个人简历68
灵芝多糖拮抗黑素瘤细胞上清对淋巴细胞免疫功能抑制作用探讨
更新时间：2024-02-06
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