水溶性单壁碳纳米管肿瘤靶向给药系统构建和热疗探讨

更新时间:2024-03-20 作者:用户投稿原创标记本站原创
摘要:单壁碳纳米管(SWNTs)是一种特殊的纳米,具有独特的物理学、化学和生物学特性,自被发现之日起,它就引起了人们广泛的关注。近年来,SWNTs的应用跨越了多个学科和领域,人们一直致力于研究SWNTs潜在的生物医学的应用。但是SWNTs具有疏水的表面,不溶于水以及常见的有机溶剂,生物相容性差严重限制了其在生物医学中的应用。因此,改善SWNTs的生物相容性是解决SWNTs生物医学应用的首要问题。SWNTs具有较强的跨细胞膜能力,因此功能化的SWNTs携带多种有机或无机粒子(其中包括蛋白质、核酸和化学药物等活性分子)细胞内部并且不表现出毒性。传统物理功能化的方法,可以使碳纳米管达到分散的目的,但是物理功能化的方法经常伴表面活性剂毒性高、在体内容易解聚等缺点,在实际应用中十分有限。因此,构建具有肿瘤靶向性的化学功能化碳纳米管具有科学和广泛的应用前景。生物系统对700-1,100nm范围的近红外光具有透过性,而SWNTs在此范围内具有高吸收的特性,可以利用SWNTs在此范围内的光热转换特性对肿瘤激光热疗。将SWNTs肿瘤靶向给药系统和激光热疗联合应用可以达到更加的抗肿瘤作用。本论文主要构建了聚乙烯亚胺(PEI)共价功能化的SWNTs肿瘤靶向给药系统,并且研究了该给药系统在裸鼠体内和体外的抗肿瘤活性作用及其联合热疗的抗肿瘤活性作用,其主要内容如下:1.SWNT-PEI的合成及表征。纯化、氧化、氨基化和PEI聚合化等对SWNTs化学功能化。使用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、核磁共振(NMR)、透射电镜(TEM)、原子力显微镜(AFM)、热重分析(TGA)、粒度分析(PSD)等仪器对所合成的SWNTs样品表征。结果,经过一系列的化学功能化,在SWNTs表面有聚合化的PEI形成,并且SWNTs本身的结构基本无变化,具有良好的粒径分布,在数星期数月中保持稳定。2. SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统的构建。在SWNT-PEI中加入一定量的二硬脂酸磷脂酰胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG2000-Maleimide),π-π堆积连接在SWNTs上,利用其尾端的马来酰亚胺巯基连接含有NGR基序(天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸,Asn-Gly-Arg)的多肽序列,使SWNTs载体系统具有肿瘤血管靶向性。静电作用,使带负电的hTERTsiRNA与SWNT-PEI载体形成肿瘤治疗靶向给药系统。使用紫外全波长扫描和琼脂糖凝胶电泳(AGE)确定SWNTs载体系统荷载siRNA的情况;利用荧光分光光度法检测NGR靶头的连接情况;考察靶向给药系统的载药性能和稳定性。结果,SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统荷载siRNA完全,成功连接了NGR多肽靶向基团。结果,SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统具有较好的稳定性和生物相容性。3.考察SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统对PC-3人前列腺癌细胞的抗肿瘤活性。使用苯磺罗丹明B(SRB)法考察空白载体对肿瘤细胞的毒性作用及靶向给药系统对肿瘤细胞存活率的影响;使用荧光显微镜考察不同时间内肿瘤细胞对载体系统的摄取情况;流式细胞仪分析肿瘤细胞的凋亡情况;RT-PCR和Western Blotting分析细胞内hTERT mRNA和蛋白的表达情况。结果,SWNT-PEI空白载体在剂量范围内对PC-3人前列腺癌细胞毒性很小;SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向载体系统在4h内被细胞摄取完全,且转染率约为单纯PEI的两倍;释放的siRNA抑制细胞内hTERTmRNA和蛋白的表达,并且使细胞产生凋亡。4.考察SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统对裸鼠主要器官的毒性作用、体内分布及对PC-3荷瘤裸鼠肿瘤的抑瘤效果。以PC-3荷瘤裸鼠为研究对象,对裸鼠心、肝、脾、肺和肾组织的HE染色切片分析,证明了靶向给药系统对裸鼠主要脏器在剂量范围内毒性;利用量子点(QDs)对SWNTs载体系统标记,考察了SWNTs载体在裸鼠体内的生物分布情况;定期测量荷瘤裸鼠肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线,证明了SWNT-PEI/siRNA/NGR对肿瘤有抑制作用;体内肿瘤RT-PCR、Western和凋亡检测结果,载体系统可以抑制hTERT mRNA、蛋白的表达,并且促使细胞凋亡5.考察SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向载体系统联合热疗的抗肿瘤效果,对808nm近红外激光热疗效果了体内和体外的评价。808nm激光热疗体外结果,SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向载体系统的发热效率具有SWNTs浓度依赖性和时间依赖性;SWNT-PEI/siRNA/NGR联合热疗组与各对照组相比,对PC-3肿瘤细胞的增值有的抑制作用;对裸鼠肿瘤体积的考察,热疗组治疗效果优于单纯载体系统组。本论文中的方法构建的SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统无论在体内还是在体外都具有良好的抗肿瘤活性,并且将siRNA基因沉默治疗和热疗联合后对SWNTs肿瘤靶向给药系统的抗肿瘤活性更加。关键词:单壁碳纳米管论文聚乙烯亚胺论文共价功能化论文肿瘤靶向论文siRNA论文热疗论文
摘要4-7
Abstract7-11
英文縮略词表11-19
前言19-21
第1章 绪论21-43
1.1 引言21-22
1.2 碳纳米管的结构和性能22-23
1.3 碳纳米管的制备23-24
1.4 碳纳米管的毒性24-25
1.4.1 碳纳米管的体外毒性24
1.4.2 碳纳米管的体内毒性24-25
1.5 碳纳米管的功能化25-29
1.5.1 碳纳米管的非共价功能化25-27
1.5.2 碳纳米管的共价功能化27-29
1.6 功能化碳纳米管作为载体的应用29-32
1.6.1 碳纳米管荷载蛋白质30
1.6.2 碳纳米管荷载核酸30-32
1.6.3 碳纳米管荷载化学药32
1.6.4 碳纳米管荷载中药32
1.7 碳纳米管的体内分布32-34
1.8 本课题的主要研究内容34-36
参考文献36-43
第2章 SWNT-PEI的制备及性质考察43-60
2.1 引言43-44
2.2 实验44-45
2.2.1 仪器44-45
2.2.2 试剂45
2.3 实验方法45-49
2.3.1 单壁碳纳米管的纯化45-46
2.3.2 单壁碳纳米管的羧基化46
2.3.3 单壁碳纳米管的氨基化46-47
2.3.4 单壁碳纳米管的PEI聚合化47
2.3.5 傅立叶红外光谱(FT-IR)47
2.3.6 核磁共振图谱(NMR)47-48
2.3.7 透射电镜(TEM)48
2.3.8 原子力显微镜(AFM)48
2.3.9 粒径和电位考察48-49
2.3.10 热重分析(TGA)49
2.3.11 功能化SWNTs水溶性考察49
2.4 结果与讨论49-59
2.4.1 单壁碳纳米管的纯化49-50
2.4.2 单壁碳纳米管的羧基化50-52
2.4.3 单壁碳纳米管的氨基化52-54
2.4.4 单壁碳纳米管的聚合化54-57
2.4.5 SWNT-PEI溶液的稳定性57-59
2.5 小结59-60
第3章 SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统的构建和体外研究60-101
3.1 引言60-61
3.2 实验61-66
3.2.1 仪器61-62
3.2.2 试剂62-64
3.2.3 试剂配制64-66
3.2.4 siRNA序列及引物序列66
3.2.5 NGR多肽序列66
3.3 实验方法66-77
3.3.1 SWNTs含量测定方法的建立66-67
3.3.2 SWNT-PEI/siRNA载体系统的构建67-68
3.3.3 SWNT-PEI/siRNA/NGR载体系统的构建68
3.3.4 SWNT-PEI/siRNA/NGR载体系统的包封情况68
3.3.5 NGR靶向修饰的验证68-69
3.3.6 SWNT-PEI/siRNA/NGR载体系统的稳定性69
3.3.7 细胞的培养方法69-70
3.3.8 免疫细胞化学染色70-71
3.3.9 SWNTs载体系统体外细胞摄取实验71
3.3.10 SWNTs载体系统细胞转染率测定71-72
3.3.11 SRB法测定载体系统对细胞存活率的影响72
3.3.12 RT-PCR实验72-75
3.3.13 Western Blotting实验75-77
3.3.14 细胞凋亡实验77
3.4 结果与讨论77-100
3.4.1 SWNTs含量的测定78-80
3.4.2 电泳检测载体系统包封情况80-81
3.4.3 UV-Vis检测载体系统荷载siRNA的情况81-82
3.4.4 SWNT-PEI/siRNA/NGR载体系统透射电镜(TEM)检测82-83
3.4.5 NGR靶向修饰的验证83-84
3.4.6 SWNT-PEI/siRNA/NGR包封情况的考察84-85
3.4.7 SWNT-PEI/siRNA/NGR稳定性考察85-86
3.4.8 免疫细胞化学86-88
3.4.9 SWNTs载体系统体外细胞摄取实验88-91
3.4.10 SWNTs载体系统体外细胞转染率测定91-92
3.4.11 SRB法测定细胞存活率92-94
3.4.12 RT-PCR实验结果94-96
3.4.13 Western Blotting实验结果96-98
3.4.14 细胞凋亡实验结果98-100
3.5 小结100-101
第4章 SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统的体内研究101-125
4.1 引言101
4.2 实验101-103
4.2.1 仪器101-102
4.2.2 102-103
4.3 实验方法103-108
4.3.1 荷瘤裸鼠模型的建立103
4.3.2 SWNTs载体系统对裸鼠体内主要器官的影响103-104
4.3.3 SWNT-PEI/NGR/QDs的制备104-105
4.3.4 SWNTs载体系统在裸鼠体内的分布105
4.3.5 肿瘤生长抑制率的考察105-106
4.3.6 RT-PCR检测裸鼠肿瘤中的hTERT mRNA的表达106
4.3.7 Western检测体内肿瘤中hTERT蛋白的表达106-107
4.3.8 瘤组织凋亡研究107-108
4.4 结果与讨论108-124
4.4.1 裸鼠PC-3肿瘤模型的制备108-109
4.4.2 SWNTs载体系统对裸鼠体重和主要脏器的影响109-112
4.4.3 SWNT-PEI/NGR/QDs的制备112-113
4.4.4 SWNTs载体在裸鼠体内的分布113-118
4.4.5 载体系统对裸鼠肿瘤的抑制作用118-119
4.4.6 载体系统对裸鼠肿瘤中hTERT mRNA表达的影响119-121
4.4.7 载体系统对裸鼠肿瘤中hTERT蛋白表达的影响121-122
4.4.8 载体系统对裸鼠肿瘤的凋亡作用122-124
4.5 小结124-125
第5章 SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统的热疗研究125-136
5.1 引言125
5.2 实验125-127
5.2.1 仪器125-126
5.2.2 试剂126-127
5.3 实验方法127-128
5.3.1 激光照射下的发热实验127
5.3.2 激光照射下载体系统对细胞存活率的影响127
5.3.3 激光照射下SWNTs载体系统在对肿瘤的治疗作用127-128
5.3.4 激光照射下裸鼠肿瘤组织的HE染色128
5.3.5 激光照射下载体系统对裸鼠肿瘤组织的凋亡作用128
5.4 结果与讨论128-135
5.4.1 体外发热实验128-129
5.4.2 激光照射下载体系统对细胞存活率的影响129-131
5.4.3 激光照射下载体系统对裸鼠肿瘤的治疗作用131-133
5.4.4 激光照射下裸鼠肿瘤组织的HE染色133-134
5.4.5 激光照射下载体系统对裸鼠肿瘤组织的凋亡作用134-135
5.5 小结135-136
全文总结136-137
参考文献137-144
致谢144-145
个人简介145-146

一、教育背145

二、在读期间发表的文章145-146

三、在读期间申请专利146

四、在读期间参加的科研项目146

五、在读期间参加的学术活动146

六、在读期间的奖励146

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