简论转录能源微藻筛选及其基因工程基础经典

更新时间：2024-03-26 作者：用户投稿原创标记本站原创
摘要：随着日益增加的能源需求,许多国家都已开展了各种可再生能源的开发。比较传统的化石燃料,生物燃料更为环保,且可再生,能完全取代传统的燃料。然而生物燃料的生产原料成本过高限制了当前生物燃料的普及。寻求更为廉价的生物燃料的原料是目前生物燃料探讨领域的主要方向。微藻为光合自养微生物,比较于其他油料作物,其具有生长速度快,脂质含量高,且无需耕地不与粮食作物争地等诸多优点,是目前最有优势的生物能源原料。进一步提升微藻的生物量和脂质含量,提升其生物能源产量,将使其在生物能源生产中更具优势,这是微藻生物能源领域的努力方向和探讨热点。本论文针对生物能源微藻的基因工程进行了基础探讨,主要开展了微藻选取、培养优化以及以进一步基因改造为目的的基础探讨,包括,脂质代谢途径探讨和基因工程改造微藻的后续探讨基因筛选。同时在构建载体进行工程微藻改造历程中,针对实验需要,开发了微藻colony PCR技术。(1)高生物量高脂质微藻的筛选以各地水样中筛选的多株微藻中选取了一株新的微藻藻株,经鉴定为Chlorella sorokiniana,命名为CS-01。该藻株生长速度较快,pH适应范围广,7-10之间均能很好地生长,在pH9时生长最佳；最适培养温度为30℃,20℃～35℃均能较好生长。最适氮源为硝酸钠,也能很好的利用尿素作为氮源,不能较好利用硫酸铵作为氮源生长。也能利用多种碳源生长,其中以葡萄糖生长时,生长和脂质含量最佳。鉴于该藻在生物燃料的运用潜力,选为本探讨的目的微藻。(2)目的微藻针对生物燃料生产的培养优化与其他限制培养基中的氮源来提升脂质含量的策略不同,经由兼养、异养和足量铁培养,淡水微藻C. sorokiniana CS-01生物产量和脂质含量都有大幅提升,其中,兼养时,细胞量是光合自养的4.2倍,脂质含量以光合自养的22%左右提升到50%。异养时,细胞量是光合自养的9.2倍,脂质含量超过50%。铁培养时,脂质浓度达到最大为36%,是完全不加铁培养(12%)的3倍,最高细胞浓度为无铁培养物的1.7倍。且该藻株也展现了相对其他小球藻更强的葡萄糖耐受能力,比海洋微藻C. vulgaris更强的铁耐受能力。经兼养和异养的小球藻CS-01的脂质主要为中性脂且饱和度高,能够用于生产高质量的生物燃料。且该藻株展现了相对其他小球藻更强的葡萄糖耐受能力,比海洋微藻C. vulgaris更强的铁耐受能力。(3)在脂质高积累和低积累时脂质合成相关基因表达差别浅析通过不同培养条件下,基因表达变化与细胞生长和脂质含量对应联系,本探讨发现rbcL基因的表达可以用来反映光合作用的速率；兼养条件下,C.sorokiniana CS-01优先进行异养。在完全异养初期,参与光合作用的rbcL基因仍保留少量表达,但进入稳定期表达量则急剧降低。AccD基因的表达水平除在异养时与残余葡萄糖浓度相关外,在其他培养方式下则与脂质含量相关,由此,可作为在非异养条件下评估脂质含量的分子检验手段之一。C. sorokiniana CS-01同质ACCase和异质ACCase保留着不同分工,但同质ACCase对总的脂质积累贡献较少。铁浓度增高能同时提升rbcL,accD和accl基因的表达量,可能是高浓度的铁造成细胞脂质含量提升的理由之一。(4)在脂质高积累和低积累时Genefishing浅析Genefishing策略是探讨基因组整体表达差别的简单快捷的策略,并能用来快速寻找那些表达量受特定条件影响显著的基因。经由Genefishing浅析了不同浓度铁培养时基因的表达图谱,证实了铁能推动许多基因的表达,同时在Genefishing发现的序列中,经由生物信息学策略,发现了两个可能与脂质合成代谢相关的基因,它们也随铁的浓度的增加而表达量提升。(5)目的微藻的转录组测序及其脂质合成代谢途径浅析经由改善的cDNA文库制备策略,本探讨首次对淡水微藻C. sorokiniana进行了全转录组测序,并进行了序列片段的拼接,对拼接序列进行基因本体浅析和进一步的序列功能注释,获得了该藻大量基因的信息,进一步充实了微藻基因库信息。经由转录文库中出现的基因所编码的酶,预测了以CO2到细胞主要中性脂Triacylglycerols (TAG)合成的完整路径,以及脂肪酸的合成、延长、代谢途径。标记了TAG合成途径上的分支点,进而展现碳流向可能具有的分支,为脂质提升的基因工程指明了方向。本探讨也识别了大量与生长和死亡相关的基因。在本探讨中获得的大量基因和代谢途径信息,为基因层面改造微藻提供了有力的论述支持。(6)脂质高积累和低积累时全转录组表达差别对微藻在不同脂质高积累和低积累时的全转录库进行了测序,比较了不同培养条件下全基因组的表达差别变化。发现了大量随脂质变化基因,且即使在不同个样品这些基因的表达仍展现了与脂质变化完全相同的关联,其中许多基因目前功能尚未确定,但根据其表达变化,很可能与脂质合成相关,这些基因的进一步剖析和验证,将有助于深入了解微藻的脂质合成代谢,以及发现更多新的脂质合成相关基因。此外,也发现了一些功能未知,但在多个样品间都具有超高表达量的基因,其表达操作元件能够为构建高表达载体提供参考。(7)微藻colony PCR技术构建工程微藻的转化历程中需要验证大量的微藻转化体,但是获得PCR验证所需DNA模板却非常费时费力。由此,开发微藻的colony-PCR技术,可以不对微藻进行单独培养和DNA提取,能快捷识别转化子,这能大幅提升基因工程改造微藻的效率。本探讨比较了5种colony PCR DNA析出液用于微藻colony-PCR的效果。结果显示Chelex-100效果最好,能够完好地扩增细胞核和叶绿体中基因片段。此外,Chelex-100在colony-PCR历程中展现出强的DNA提取能力、高抗干扰性、良好的DNA保存效果和细胞量变化适应性,对后续的PCR反应影响小。该策略具有高通量地识别微藻转化子的核转化和叶绿体转化的能力,用于微藻基因的扩增,不需繁琐的DNA提取历程,能在微藻的基因改造历程作为DNA检验手段得到广泛的运用。关键词：生物燃料论文微藻论文脂质论文Genefishing论文转录组测序论文
本论文由www.808so.com摘要4-7
ABSTRACT7-11
符号说明11-12
目录12-16
第一章 文献综述16-25
1.1 引言16
1.2 微藻生物柴油概述16-19
1.2.1 微藻作为生物柴油原料的优势17-18
1.2.2 微藻生物柴油开发的必要性18-19
1.3 微藻培养及其优化19-20
1.3.1 微藻生物柴油生产的基本流程19
1.3.2 高脂质积累能力微藻选育及培养19-20
1.4 工程微藻探讨进展20-23
1.4.1 微藻的外源DNA导入策略近况21
1.4.2 筛选标记及其启动子探讨21
1.4.3 基因探讨21-23
1.5 本论文的探讨目标和探讨内容23-25
1.5.1 本论文的探讨目标23-24
1.5.2 主要探讨内容24
1.5.3 论文资助与国际合作情况24-25
第二章 目的微藻Chlorella sorokiniana CS-01的选育25-32
2.1 引言25
2.2 材料与策略25-27
2.2.1 藻株的分离与培养25-26
2.2.2 形态学观察和生理检验26
2.2.3 18S rRNA基因系统发育学鉴定26-27
2.2.4 细胞生物量测定和生化成分浅析27
2.3 结果与讨论27-31
2.3.1 藻株细胞形态特点27-28
2.3.2 系统发育鉴定28
2.3.3 生理性状28-31
2.4 本章小结31-32
第三章 Chlorella sorokiniana CS-01以生物燃料为目的的培养优化32-49
3.1 引言32-33
3.2 材料与策略33-34
3.2.1 培养条件33
3.2.2 细胞生物量测定和生化成分浅析33-34
3.2.3 脂质成分浅析34
3.3 结果34-44
3.3.1 兼养对三株微藻生长和脂质含量的影响34-37
3.3.2 兼养下三株微藻葡萄糖消耗速率37-38
3.3.3 兼养对细胞脂质组成的影响38-39
3.3.4 异养对细胞生长和脂质含量的影响39-40
3.3.5 异养条件下细胞成分与葡萄糖消耗速率40-42
3.3.6 异养条件对细胞脂质组成的影响42-43
3.3.7 铁对细胞生长和脂质含量的影响43-44
3.4 讨论44-47
3.5 本章小结47-49
第四章 基因rbcL,accD,acc1在高低脂质各条件下的表达差别浅析49-60
4.1 引言49
4.2 材料与策略49-51
4.2.1 培养条件50
4.2.2 总RNA提取与cDNA文库合成50
4.2.3 Real-Time PCR浅析50-51
4.3 结果51-56
4.3.1 兼养对3个脂质合成相关基因表达的影响51-53
4.3.2 异养对3个脂质合成相关基因表达的影响53-54
4.3.3 铁对3个脂质合成相关基因表达的影响54-56
4.4 讨论56-59
4.5 本章小结59-60
第五章 不同铁浓度下Chlorella sorokinianaCS-01的Genefishing表达图谱60-66
5.1 引言60
5.2 材料与策略60-62
5.2.1 培养条件60-61
5.2.2 总RNA提取61
5.2.3 Genefishing浅析61
5.2.4 Real-Time PCR引物设计61
5.2.5 Real-Time PCR浅析61-62
5.3 结果与讨论62-65
5.3.1 Genefishing浅析62-64
5.3.2 Realtime-PCR验证64-65
5.4 本章小结65-66
第六章 Chlorella sorokiniana转录组测序及其脂质合成代谢途径浅析66-101
6.1 引言66
6.2 材料与策略66-68
6.2.1 微藻细胞培养66
6.2.2 总RNA提取66-67
6.2.3 cDNA文库制备67
6.2.4 测序67
6.2.5 测序结果装配与浅析67
6.2.6 序列识别注释和代谢途径构建67-68
6.3 结果与讨论68-84
6.3.1 cDNA文库制备策略改善68-69
6.3.2 测序与序列拼接69-71
6.3.3 序列的比对和注释71-73
6.3.4 以二氧化碳的固定到TAG的合成途径预测73-78
6.3.5 脂肪酸的合成、延长和代谢78-83
6.3.6 微藻生长与死亡83-84
6.4 本章小结84-85
第七章 不同培养条件下Chlorella sorokiniana全转录组表达差别85
7.1 引言85
7.2 材料与策略85-86
7.2.1 微藻细胞培养85-86
7.2.2 cDNA文库制备、测序及其装配与浅析86
7.2.3 基因表达水平浅析86
7.3 结果与讨论86-100
7.3.1 测序结果统计86-90
7.3.2 全转录库表达差别统计90-93
7.3.3 全转录库在对数期与稳定期间表达差别93-94
7.3.4 全转录库在不同铁浓度的表达差别94-95
7.3.5 全转录库在不同营养方式下的表达差别95-100
7.4 本章小结100-101
第八章 微藻colony-PCR技术101-108
8.1 引言101
8.2 材料与策略101-102
8.2.1 微藻藻株101-102
8.2.2 Colony-PCR缓冲液102
8.2.3 Colony-PCR操作流程102
8.2.4 引物102
8.3 结果与讨论102-107
8.4 本章小结107-108
全文结论108-111
参考文献111-118
致谢118-120
攻读学位期间主要的探讨成果120-121

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